Data Investigation - Mysterious Case of Excessive Exons in CEABIGR

CEABIGR
Crassostrea viriginica
Eastern oyster
2023
Author

Sam White

Published

December 6, 2023

After Steven ran through some prelimiary exon expression analyses (GitHub Isse), he noticed that there were some genes with a seemingly excessive number of exons (like over 800!). Seeing that, I’ve decided to do some investigation to see if these gene feature annotations stem from the source (i.e. from NCBI GFF) or were introduced accidentally through some subsequent data analysis/manipulations.

First, let’s look at a file which appears to provide mappings of GeneIDs and exons:

Investigate genome-features/C_virginica-3.0_Gnomon_exon-geneID.bed

Inspect exon-geneID mapping file

This might be a poor place to start, as this file exists in a directory with no README. As such, I’m not certain of the source of this file…

head /home/sam/gitrepos/ceabigr/genome-features/C_virginica-3.0_Gnomon_exon-geneID.bed
NC_035780.1 13578   13603   gene-LOC111116054
NC_035780.1 14237   14290   gene-LOC111116054
NC_035780.1 14557   14594   gene-LOC111116054
NC_035780.1 28961   29073   gene-LOC111126949
NC_035780.1 30524   31557   gene-LOC111126949
NC_035780.1 31736   31887   gene-LOC111126949
NC_035780.1 31977   32565   gene-LOC111126949
NC_035780.1 32959   33324   gene-LOC111126949
NC_035780.1 66869   66897   gene-LOC111110729
NC_035780.1 64123   64334   gene-LOC111110729

This appears to have all exons start/stop locations for each gene. At least, that’s my assumption, based off of the filename.

Count exons per gene in C_virginica-3.0_Gnomon_exon-geneID.bed

awk '{print $4}' /home/sam/gitrepos/ceabigr/genome-features/C_virginica-3.0_Gnomon_exon-geneID.bed \
| uniq --count \
| sort --numeric-sort --reverse  -k1,1 \
| head
   2889 gene-LOC111108212
   2600 gene-LOC111125463
   2237 gene-LOC111125330
   1559 gene-LOC111130297
   1557 gene-LOC111112605
   1555 gene-LOC111128998
   1540 gene-LOC111122636
   1506 gene-LOC111107250
   1384 gene-LOC111125942
   1383 gene-LOC111133666

Well, this shows us that this file indeed has many, many genes with thousands of exons! This is highly dubious, so let’s glance at the NCBI GFF to see if this is “real” or not.

Inspect NCBI GFF

Decompress NCBI GFF

gunzip --keep /home/sam/gitrepos/ceabigr/genome-features/GCF_002022765.2_C_virginica-3.0_genomic.gff.gz

Search for gene(s) with high number of exons

Note

Exons in the GFF do not refer to the full parent gene ID!

Need to use truncated version. E.g. LOC111108212

awk -F "\t" '$3 == "exon"' /home/sam/gitrepos/ceabigr/genome-features/GCF_002022765.2_C_virginica-3.0_genomic.gff \
| grep "gene=LOC111110729" \
| wc -l
5

So, the exon counts in genome-features/C_virginica-3.0_Gnomon_exon-geneID.bed are indeed artificial!

Now that I’ve investigated that, I probably should’ve just started with the input files that Steven was using in the first place. However, this certainly identifies a problematic file that should likely be removed from the repo…

Let’s look at the data Steven was working with and see what we can figure out.

Inspect output/19-exon-expression/S12M-exon_expression.tab

Count colums in output/19-exon-expression/S12M-exon_expression.tab

Due to the layout of this file (a column for each possible number of exons across all genes), the head command will produce an unwieldy output. Instead, we’ll just count the number of columns (fields) to get an idea of what we’re dealing with.

Note

We subtract 1 to account for the first column

S12M.columns <- system("awk '{print NF-1}' /home/sam/gitrepos/ceabigr/output/19-exon-expression/S12M-exon_expression.tab | sort --unique",
                       intern = TRUE)

Well, we’re seeing that there is a maximum number of exons across all genes: 462

Next let’s see if we can ID the gene with 462 exons.

library(dplyr)

S12M.df <- read.csv("/home/sam/gitrepos/ceabigr/output/19-exon-expression/S12M-exon_expression.tab",
                    sep = "\t")

str(S12M.df)
'data.frame':   38838 obs. of  463 variables:
 $ gene_name: chr  "gene-LOC111116054" "gene-LOC111126949" "gene-LOC111110729" "gene-LOC111112434" ...
 $ exon_1   : int  130 22 282 24 69 416 193 23 23 3 ...
 $ exon_2   : int  103 180 63 40 39 NA 106 173 173 1 ...
 $ exon_3   : int  9 35 55 123 86 NA NA 3 NA 2 ...
 $ exon_4   : int  NA 110 11 NA 21 NA NA 1 NA 2 ...
 $ exon_5   : int  NA 47 NA NA 85 NA NA 2 NA NA ...
 $ exon_6   : int  NA NA NA NA NA NA NA 2 NA NA ...
 $ exon_7   : int  NA NA NA NA NA NA NA 75 NA NA ...
 $ exon_8   : int  NA NA NA NA NA NA NA 214 NA NA ...
 $ exon_9   : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_10  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_11  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_12  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_13  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_14  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_15  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_16  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_17  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_18  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_19  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_20  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_21  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_22  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_23  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_24  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_25  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_26  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_27  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_28  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_29  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_30  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_31  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_32  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_33  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_34  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_35  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_36  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_37  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_38  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_39  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_40  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_41  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_42  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_43  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_44  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_45  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_46  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_47  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_48  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_49  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_50  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_51  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_52  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_53  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_54  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_55  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_56  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_57  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_58  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_59  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_60  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_61  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_62  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_63  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_64  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_65  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_66  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_67  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_68  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_69  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_70  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_71  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_72  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_73  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_74  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_75  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_76  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_77  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_78  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_79  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_80  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_81  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_82  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_83  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_84  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_85  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_86  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_87  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_88  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_89  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_90  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_91  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_92  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_93  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_94  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_95  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_96  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_97  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
 $ exon_98  : int  NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ...
  [list output truncated]
result <- S12M.df %>%
  filter(!is.na(exon_462) & grepl("[0-9]", exon_462))

print(result$gene_name)
[1] "gene-LOC111119012"
selected_gene_names <- result$gene_name

Okay, we’ve identified gene-LOC111119012 as the gene which contains 462. Let’s see if this matches the original NCBI GFF.

Compare number of exons in gene-LOC111119012 between S12M-exon_expression.tab and GCF_002022765.2_C_virginica-3.0_genomic.gff

awk -F "\t" '$3 == "exon"' /home/sam/gitrepos/ceabigr/genome-features/GCF_002022765.2_C_virginica-3.0_genomic.gff \
| grep "gene=LOC111119012" \
| wc -l
268

Okay, they do not match, which points to an issue with S12M-exon_expression.tab! I generated that file in 19-exon-expression.Rmd using the Ballgown exon file (e_data.ctab) file as a source. Let’s check that first before I re-examine 19-exon-expression.Rmd.

Compare total exons in e_data.ctab and GCF_002022765.2_C_virginica-3.0_genomic.gff

Count exons in S12M e_data.ctab.

S12M.edata.df <- read.csv("/home/sam/gitrepos/ceabigr/data/ballgown/S12M/e_data.ctab",
                          sep = "\t")

str(S12M.edata.df)
'data.frame':   352757 obs. of  12 variables:
 $ e_id   : int  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ...
 $ chr    : chr  "NC_007175.2" "NC_007175.2" "NC_007175.2" "NC_007175.2" ...
 $ strand : chr  "+" "+" "+" "+" ...
 $ start  : int  1 1710 8250 2645 3430 3499 3578 3647 4897 5673 ...
 $ end    : int  1623 2430 8997 3429 3495 3567 3646 4859 5589 5743 ...
 $ rcount : int  3406 26400 15868 1336 52 53 41 2586 1190 38 ...
 $ ucount : int  3406 26400 15868 1336 52 53 41 2585 1190 38 ...
 $ mrcount: num  3406 26400 15868 1336 52 ...
 $ cov    : num  232.4 4148.4 2338.9 181.2 68.7 ...
 $ cov_sd : num  159.7 3089.9 2148.5 67.5 3.4 ...
 $ mcov   : num  232.4 4148.4 2338.9 181.2 68.7 ...
 $ mcov_sd: num  159.7 3089.9 2148.5 67.5 3.4 ...
exon.count.S12M.edata <- nrow(S12M.edata.df)

print(exon.count.S12M.edata)
[1] 352757

Count exons in GCF_002022765.2_C_virginica-3.0_genomic.gff

exon.count.ncbi.gff <- system("awk -F '\t' '$3 == \"exon\"' /home/sam/gitrepos/ceabigr/genome-features/GCF_002022765.2_C_virginica-3.0_genomic.gff | wc -l", intern = TRUE)

print(exon.count.ncbi.gff)
[1] "731916"

Number of exons in e_data.ctab: 352757

Number of exons in NCBI GFF: 731916

So, we’re seeing that S12M e_data.ctab has ~50% of the total number of exons in the Crassostrea virginica (Eastern oyster) genome (as annotated by NCBI). This makes sense to me, as the data we’re using is RNAseq. So, not all genes are going to be expressed and, thus, we won’t have data for each gene/exon in the genome.

Regardless, based off of the difference in exon counts of gene-LOC111119012 in GCF_002022765.2_C_virginica-3.0_genomic.gff and S12M-exon_expression.tab, I will revisit 19-exon-expression.Rmd to see where things might have gone wrong.